很长一段时间里，驱动基因阳性肺癌患者可以选择靶向治疗，驱动基因阴性患者只能用化疗。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂给很多驱动基因阴性肺癌提供了新选择，不少患者得以长期生存。
 
遗憾的是，免疫检查点抑制剂也面临耐药的挑战，耐药机制的复杂程度，相比靶向治疗，有过之无不及。
 
本文主要从肿瘤细胞和免疫细胞两个方面，盘点了免疫治疗耐药机制的关键研究。
 
一、肿瘤细胞
 
肿瘤细胞是正常细胞恶变而来，具有正常细胞所没有的新抗原（肿瘤抗原），这些肿瘤抗原被免疫细胞发现后，免疫系统会发起攻击，将之清除。
 
然后，如果肿瘤细胞没有表达免疫细胞可以识别的抗原，或者虽表达肿瘤抗原，但抗原呈递机制异常，免疫系统就不会发现恶变的肿瘤细胞，也就不会发起攻击，导致免疫治疗无法发挥功效。
 
再就是细胞信号通路异常，免疫系统认为“天下天平”，免疫治疗也无能为力。
 
（一）PD-L1同族兄弟B7-H3表达上调 预后不良
 
免疫检查点PD-1及其受体B7-H1（PD-L1）是免疫治疗的作用靶点，但对其他B7家族成员知之甚少。
 
B7家族成员之一的B7-H3（CD276）是一种I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白（Ig）超家族。虽然人体内B7-H3 mRNA广泛存在于多个器官，包括乳腺、膀胱、肝脏、肺、淋巴器官、胎盘、前列腺和睾丸，但在蛋白质水平上，B7-H3表达较低且罕见。据报道，在包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种恶性肿瘤中，B7-H3表达上调。
 
在临床前模型中，在T细胞主导的癌症免疫中，推测B7-H3既有刺激作用，也有抑制作用。在人类肝细胞癌中，B7-H3表达与T细胞增殖减少和干扰素-γ生成减少相关。
 
在胰腺癌小鼠模型中，阻断B7-H3，可增加CD8+T细胞流入和抗肿瘤作用。在NSCLC中，B7-H3蛋白表达与预后不良相关。在一项1期研究中，一种针对B7-H3的人源化Fc优化单克隆抗体Enoblituzumab（也称为MGA271），在部分预治疗实体瘤中显示出抗肿瘤反应，且耐受性良好。目前，Enoblituzumab单药或与CTLA-4或PD-L1单克隆抗体联合的临床研究，正在进行中。尚不清楚B7免疫调节分子共表达的生物学意义、它们在肿瘤微环境（TME）中的相互作用，以及它们对PD-1轴抑制剂原发性和获得性耐药的影响。
 
2017年9月，Altan等发表在《Clin Cancer Res》的一项研究[1]，测定了NSCLC患者B7-H3蛋白的表达水平，并评估了其与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、PD-L1、B7-H4的相关性，还评估3个NSCLC队列的主要临床病理特征。
 
使用多重自动定量免疫荧光法（QIF），评估了634例NSCLC患者。结果发现，B7-H3蛋白表达率为80.4%（510/634）。B7-H3蛋白水平较高（前10个百分位）与总生存率较低相关（P＜0.05）。
 
在3个队列中，B7-H3升高与吸烟史相关，但与性别、年龄、临床分期和组织学无关。
 
B7-H3和PD-L1共表达病例占17.6%（112/634），与B7-H4共表达病例占10%（63/634）。仅在1.8%（12/634）的NSCLC患者同时检测到B7-H4和PD-L1。B7-H3的表达与CD3-、CD8-和CD20-阳性TIL的水平无关。
 
这项研究表明，多数NSCLC患者表达B7-H3蛋白，并与吸烟史相关。B7-H3蛋白水平较高对肺癌预后有负面影响。B7-H3与PD-L1和B7-H4共表达相对较低，表明这些靶点有一定生物学作用。
 
（二）免疫抑制受体LAG-3的新配体—FGL1升高 预后不良
 
淋巴细胞活化基因3（LAG-3，CD223）是一种跨膜蛋白，主要存在于活化的T细胞上。LAG-3蛋白由4个与CD4高度同源的细胞外Ig样结构域（D1-D4）组成。在活化的T细胞上，IL-2和IL-12可上调LAG-3表达，LAG-3主要作为传递抑制信号的受体发挥作用。
 
LAG-3的主要配体是主要组织相容复合体II型（MHC-II）。然而，LAG-3发挥免疫抑制功能，MHC-II是否为唯一起作用的配体，仍存在争议。
 
2019年1月，Wang等发表在《Cell》的一项研究[2]，证明纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）（一种肝分泌蛋白）是LAG-3的另一种主要功能配体，独立于MHC-II。
 
FGL1可抑制抗原特异性T细胞活化，敲除小鼠的FGL1可促进T细胞免疫。单克隆抗体可阻断FGL1-LAG-3相互作用，刺激肿瘤免疫，并以受体-配体相互依赖的方式治疗肿瘤模型小鼠。
 
人体中的癌细胞可产生大量FGL1，患者血浆中FGL1升高与预后不良和抗PD-1/B7-H1治疗耐药相关。该研究揭示了一种免疫逃避机制，并对癌症免疫治疗的设计具有指导意义。
 
（三）IL-8升高 免疫治疗化疗结局较差
 
C-X-C基序趋化因子配体8（CXCL8，也称为IL-8），是第一个被发现的趋化因子，是多种癌症都有表达的一种血管生成多肽。IL-8可有效调节人体中中性粒细胞的趋化性，有直接致瘤作用，包括促进血管生成、肿瘤细胞去分化（例如，上皮-间质转化）和侵袭和/或转移。IL-8趋化活性对肿瘤中中性粒细胞和其他T细胞抑制性髓系细胞的作用，目前为止所知甚少。
 
研究者报告，在接受免疫检查点抑制剂治疗的晚期黑色素瘤或NSCLC患者的小型回顾性队列中，早期血清IL-8水平升高是结局不良的一个强有力预测因子，这表明IL-8表达与抗肿瘤免疫再活化无效有关。
 
2020年5月，Schalper等发表在《Nat Med》的一项研究[3]，通过对4项3期随机临床试验的回顾，评估了血清IL-8水平对晚期癌症患者抗肿瘤结局的影响。结果发现，在3期临床试验中，基线血清IL-8水平升高与晚期癌症患者（n=1344）纳武利尤单抗和/或伊匹单抗、依维莫司或多西紫杉醇治疗结局较差相关。
 
这表明，评估血清IL-8水平对于识别不良肿瘤免疫生物学有重要作用，可作为免疫检查点抑制剂治疗患者的独立生物标志物。
 
（四）β2M缺失 介导NSCLC免疫治疗获得性耐药
 
目前对肺癌免疫检查点抑制剂原发性和获得性耐药的机制，知之甚少。非同义突变负荷较低，与黑色素瘤和肺癌对免疫治疗原发性耐药相关。在NSCLC中，尽管依据所使用的生物标志物有一定差异，没有检测出PD-L1表达的肿瘤对这些药物反应较低。这些因素是否也免疫检查点抑制剂获得性耐药性有关，尚未确定。
 
截至目前，在肺癌中，新抗原丢失与对免疫检查点抑制剂获得性耐药相关。在黑色素瘤中，肿瘤细胞中通过JAK1/2失活突变的干扰素信号自主性缺陷，或通过β-2微球蛋白（β2M）的有害突变导致HLA I类抗原处理缺陷，可介导对PD-1抑制剂的获得性耐药。在对伊匹木单抗和帕博利珠单抗原发性耐药的黑色素瘤中，也发现了IFN信号通路的缺陷，在对帕博利珠单抗耐药的转移性结肠癌中，发现了β2M突变。进一步理解这些通路对免疫检查点抑制剂耐药的影响，非要重要。
 
2017年12月，Gettinger等发表在《Cancer Discov》的一项研究[4]，收集了14例免疫检查点抑制剂耐药肺癌患者的样本，研究了编码HLA I类抗原加工和递呈机制（APM）成分或干扰素信号的基因改变，是否在PD-1或PD-L1抑制剂获得性耐药中起作用。
 
在队列中未检测到复发突变或拷贝数变化。在一个病例中发现B2M获得性纯合子缺失，导致肿瘤和匹配的患者来源异种移植物（PDX）细胞表面HLA I类表达缺失。来自ICI耐药肿瘤的另外两个PDX也发现β2M下调。在免疫活性肺癌小鼠模型中，CRISPR介导的β2M基因敲除，在体内产生了对PD-1抑制剂耐药性，证明了其在免疫检查点抑制剂耐药中的作用。这些结果表明，HLA I类APM破坏可介导肺癌的免疫检查点抑制剂逃逸。
 
随着免疫检查点抑制剂越来越多地成为各种恶性肿瘤的标准治疗，获得性耐药的情况也越来越多。研究者发现，抗原加工和递呈有缺陷可作为肺癌免疫治疗耐药的机制。
 
（五）抗原递呈缺陷 导致NSCLC免疫治疗耐药
 
人类白细胞抗原（HLA）是人类多态性最丰富的遗传系统，与人类的免疫系统功能密切相关。其中部分基因编码细胞表面抗原，成为每个人的细胞不可混淆的“特征”，是免疫系统区分本身和异体物质的基础。因此，HLA有人体生物学“身份证”之称。
 
MHC基因产物在不同细胞表面表达，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用。HLA主要包括HLA-I类、HLA-II类和HLA-III类三个区。
 
HLA-I类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C等，分布于几乎所有有核细胞表面，以淋巴细胞表面密度最大。细胞表面的HLA-1复合物由三部分组成：HLA-1重链、β2M和源自内源性蛋白质的8～12个氨基酸肽。
 
HLA-II类基因包括HLA-D家族，主要有HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR等，主要分布于B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等专职抗原提呈细胞表面。HLA-II是膜糖蛋白，由一条α多肽链和一条β多肽链组成。
 
HLA这组基因的特征，是研究癌症发病机制中涉及复发和热点位点的一个有价值的工具。
 
2021年5月，Datar等发表在《Clin Cancer Res》的一项研究[5]，分析了HLA I类和HLA II类亚单位在NSCLC中的分布、相关免疫组织和临床意义。
 
利用空间分辨和定量多重免疫荧光技术，研究了β2M、HLA-A和HLA-B、-C重链在肿瘤/基质组织的分布、癌细胞特异性缺陷和临床病理/生存相关性，以及来自4个独立队列的＞700个免疫治疗未经治NSCLC中的HLA II类β链。使用两个公开的队列进行NSCLC患者HLA基因的基因组分析。
 
30.4%的病例发现癌细胞HLA标志物特异性下调。9.8%（70/714）β2M下调，9%（65/722）HLA-A下调，12.1%（87/719）HLA-B、-C下调，17.7%（127/717）HLA II类下调。常见β2M、HLA-B、-C和HLA II类同时下调。小于5%的肺癌检测到HLA基因的有害突变。
 
癌细胞特异性β2M下调的肿瘤T细胞减少，自然杀伤（NK）细胞浸润增加。癌细胞HLA-A下调的样本，CD8+T细胞和NK细胞浸润中度增加。癌细胞选择性HLA-B、-C或HLA II类下调的样本，T细胞和NK细胞浸润减少。
 
标志物与临床病理变量和KRAS/EGFR突变的相关性有限。癌细胞HLA亚单位选择性下调与总生存期缩短相关。
 
研究结果揭示，免疫治疗未经治NSCLC中，HLA I类和HLA II类蛋白亚单位表达的不同缺陷与TME组成不同和患者生存率相关。
 
二、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）
 
免疫治疗应答，高度依赖改变TME中效应T细胞浸润。大量活化肿瘤特异性T细胞和效应T细胞在TME的浸润，是免疫治疗应答的关键。在TME内，CD8+T细胞常处于耗竭或功能障碍的状态。
 
（一）休眠TIL 阻断PD-1后可恢复活力
 
最近的研究表明，黑色素瘤中，肿瘤突变负荷或预测的I类新抗原含量升高，与PD-1或CTLA-4抑制剂应答率和生存率更高相关。在错配修复缺陷癌症和PD-1轴抑制剂治疗的NSCLC患者中也有类似的发现。这支持了如下假设，突变越多的肿瘤可能产生更多的新表位，可被肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）识别。免疫检查点阻断抗体治疗可刺激新抗原特异性TILs，并介导肿瘤消退。其他研究表明，在肿瘤人群中，以较高等位基因频率出现的新抗原（例如，“克隆性”新抗原），在生物学上更具相关性。
 
然而，在肿瘤中，新抗原特异性淋巴细胞水平相对较低，仅可检测到少数突变表位。此外，还有一些突变负荷相对较低的肿瘤也对免疫检查点阻断剂敏感，如肾细胞癌。既往关于黑色素瘤、NSCLC和错配修复缺陷癌症的报告也表明，一些突变负荷极高的肿瘤不能从PD-1和CTLA-4阻断中明显获益。
 
对癌症基因组图谱（TCGA）数据集的分析表明，存在突变或候选MHC I类新抗原升高与穿孔素和颗粒酶-A mRNA转录水平升高相关，表明基因组水平的改变与有效抗肿瘤免疫反应存在联系。然而，哪些种类的细胞产生这些细胞溶解酶，尚未确定，这种相关性仅在某些类型肿瘤中显著，如宫颈癌（HPV阳性）、肺癌和结直肠腺癌；但在黑色素瘤、膀胱癌和肺鳞状细胞癌中不显著。使用TCGA数据库的其他研究表明，与肺腺癌相比，肺鳞癌有效免疫监测标志物减少，尽管其候选新抗原水平相当。鳞状细胞癌抗肿瘤免疫应答较低，与抗原递呈基因低表达相关，这表明不同于突变负荷的机制，可以调节这种恶性肿瘤的抗肿瘤免疫应答。
 
2018年8月，Gettinger等发表在《Nat Commun》的一项研究[6]，为了阐明肿瘤内T细胞的作用及其与肿瘤基因组景观的相关性，对接受PD-1轴阻断剂治疗NSCLC患者与治疗前样本进行配对，进行全外显子DNA测序，以及用多重定量免疫荧光（QIF）测量CD3+TIL水平、原位T细胞增殖（CD3中的Ki-67）和效应能力（CD3中的颗粒酶B）。
 
突变负荷、候选I类新抗原或肿瘤内CD3信号升高，与治疗反应良好显著相关。此外，“休眠”TIL信号与接受免疫检查点阻断剂患者生存获益相关，其特征为TIL升高，激活和增殖水平低下。本研究进一步证明，在患者来源的异种移植模型中，阻断PD-1后，休眠TIL可以恢复活力。
 
（二）VISTA一个与PD-1和PD-L1同源的新靶点
 
人类VISTA是一种包括311个氨基酸的Ig结构域的I型跨膜蛋白，在体外和体内能够抑制T细胞活化。值得注意的是，该蛋白与PD-1和PD-L1具有序列同源性，可作为抗原呈递细胞的配体和T淋巴细胞的受体。
 
既往研究表明，VISTA在CD11b+髓样细胞中高表达，而在CD4+和CD8+T细胞以及CD4+/Foxp3+T调节淋巴细胞（Treg）中低水平表达。截至目前，还没有VISTA在肿瘤细胞中表达的明确证据。
 
已经报道，在PD-1或VISTA单基因敲除动物中，慢性炎症和T细胞自发激活，并且这种表型在双基因敲除小鼠中增强。此外，与单基因敲除动物相比，双基因敲除小鼠在接受外源抗原攻击后，T细胞应答幅度协同增加，支持VISTA和PD-1通路的非冗余免疫抑制效应。尽管存在这些功能相关性，PD-1、PD-L1和VISTA在人类肿瘤中的表达模式与可能的联系，仍有待探索。近期，一项黑色素瘤小鼠模型研究表明，使用单克隆抗体阻断VISTA，可增加循环肿瘤特异性T细胞的比例，促进肿瘤免疫浸润并减缓肿瘤生长。此外，在鳞状细胞癌模型中，阻断VISTA、CTLA-4和PD-1不同程度的增加抗肿瘤作用。
 
2018年4月，Villarroel-Espindola等发表在《Clin Cancer Res》的一项研究[7]，考察了VISTA/PD-1H在人类NSCLC中的定位表达模式和临床意义。
 
采用多重定量免疫荧光法（QIF），对来自组织微阵列格式代表的3个独立队列的758例I-IV期NSCLC的VISTA、PD-1和PD-L1蛋白进行了定位测量。
 
在细胞角蛋白+肿瘤上皮细胞、CD3+T细胞、CD4+T辅助细胞、CD8+细胞毒性T细胞、CD20+B淋巴细胞和CD68+肿瘤相关巨噬细胞中选择性测定靶点。确定靶点、临床病理/分子变量与生存率之间的相关性。还对来自TCGA的肺癌病例进行了基因组分析。
 
99%的NSCLC检测到VISTA蛋白，以膜/细胞质染色模式为主。肿瘤和间质细胞的表达率分别为21%和98%。
 
VISTA水平与PD-L1、PD-1、CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞呈正相关。VISTA在T淋巴细胞中的表达高于巨噬细胞；而在细胞毒性T细胞中的表达高于辅助性T细胞。
 
VISTA升高与肺腺癌EGFR突变缺失和突变负荷降低相关。肿瘤小室中存在VISTA，预示着5年生存期更长。
 
VISTA在人类NSCLC中频繁表达，并与肿瘤浸润淋巴细胞增多、PD-1轴标记物、特异性基因组改变和结局相关。这些结果支持VISTA在人类NSCLC中发挥免疫调节作用，并提示其作为治疗靶点的潜力。
 
（三）“燃烧型”CD8+T细胞亚群 与耐药相关
 
在TME中，CD8+T细胞的分化可能发生改变，导致其异质性更为复杂。同时，人类TME是一种复杂而独特的生态系统，由肿瘤遗传多样性、空间异质性和抗肿瘤治疗的非对称改变组成，这更可能有助于形成CD8+TIL的多样性，并可能决定CD8+TIL独特的分化途径。因此，通过深入了解存在功能障碍的CD8+TILs，可改善患者T细胞的抗肿瘤反应。
 
2021年7月，Sanmamed等发表在《Cancer Discov》的一项研究[8]，采用两种方法，使用单细胞质量细胞仪和组织成像技术，从25例可切除患者和35例晚期NSCLC患者中分离TIL。
 
研究者确定了一个“燃烧型”CD8+TIL亚群（Ebo），该亚群在TME中特异性积累，但不在邻近的非肿瘤组织中积累。Ebo的增殖和活化标志物表达最高，但产生的IFNγ量最低，是高凋亡的CD8+TIL亚群。
 
该研究使用人源性患者肿瘤异种移植模型，证明了Ebo在TME内以PD-1/B7-H1通路依赖的方式扩增。基线肿瘤组织中Ebo丰度与NSCLC患者抗PD治疗的耐药相关。该研究确定了一个功能失调的TIL亚群，特征与既往描述的耗竭T细胞不同，并意味着一种克服免疫治疗耐药的新策略。
 
总之，该研究识别出一个高增殖、过度激活和高凋亡的功能失调肿瘤浸润CD8+亚群，其功能不同于既往描述的耗竭型T细胞。在肺癌组织中这一亚群以PD-1/B7-H1依赖性方式扩增，其丰度与肿瘤免疫治疗耐药相关，因此为一种潜在的组织生物标志物。
 
三、克服免疫治疗耐药 确定耐药机制是关键
 
免疫耐药是动态而又复杂的过程，存在着多种多样的耐药机制，并且多种耐药机制可相互关联、相互影响。肿瘤本身和免疫微环境的适应性变化，均可导致免疫治疗耐药。
 
确定耐药机制对于设计治疗干预策略至关重要。积极发展新技术，进行耐药后临床研究，基于耐药机制研发新型药物，则是克服免疫治疗耐药的关键。  
 
 

 
 
（环球医学编辑：丁好奇）