一、概述

重症感染是重症医学科最常见的疾病，也是影响患者病死率的主要因素之一。感染诊断既往主要依靠的是病原学检测（涂片、培养、病理及免疫学方法），但是病原学有时间上的限制，免疫学的敏感度和特异度也会影响诊断的准确性。随着对基因结构的深入了解及检测技术的发展，尤其是分子生物学诊断技术应用越来越广泛，从分子水平对感染性病原体的RNA、DNA、蛋白质等检测，可以早期、快速、敏感、特异进行诊断，为患者提供高效的治疗指导。基因诊断主要通过分子生物学方法对患者体内的遗传物质结构和表达水平进行检测，对相应的基因进行突变分析，以达到诊断特定疾病的目的。不同种的微生物所具有的特定基因序列可用于微生物鉴定，某种病原的DNA序列一旦被确定就可以将此序列用于诊断。

二、基因诊断方法

根据核酸扩增技术不同，基因诊断方法可分为三大类：靶位扩增、探针扩增和信号扩增。靶位扩增有聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、转录介导的扩增（transcription mediated amplification，TMA）、核酸序列为基础的扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）等。探针扩增是将标记的探针与目标片段进行特异性核酸杂交扩增后测定目标片段，Qβ复制酶（Qβreplicase，QβR）、循环探针技术（cyclic probe technique，CPT）、连接酶链反应（ligase chain reaction，LCR）等。信号扩增法是将目标核酸标记后，通过增加标记核酸的浓度而提高信号强度的方法，有杂交捕获系统、支链DNA（bDNA）、侵入物技术等。具体常用的有以下几类：核酸杂交、聚合酶链反应、DNA测序、基因芯片技术、免疫组化方法等。

（一）核酸杂交

核酸杂交是指从核酸分子混合液中检测特定大小核酸分子的一种方法。核酸杂交原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。杂交反应是一对一的，即一个被检测分子对应一个标记的探针分子与其杂交。杂交反应通常在一个支持膜上进行，又可称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交（Southern blot）、RNA印迹杂交（Northern blot）、点杂交和原位杂交。

在非洲及非工业化的落后的东南亚地区，沙门菌感染发病率较高，由于检测时间、检测条件及经济因素限制、诊断阳性率并不高。Frickmann等通过使用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术，可以在细菌感染时获得快速、准确诊断。新设计的FISH探针诊断临床菌株的敏感性为99.2%，特异性为98.4%，对河流等环境来源标本检测敏感性为97.4%血培养标本的菌株鉴定的敏感性100%，特异性99.5%，可见FISH技术为经济欠发达地区的沙门菌感染诊断提供了一种易行、快速、经济的办法。

（二）聚合酶链反应

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）又称体外基因扩增技术，基本原理是人工合成一对20～30个核苷酸的寡聚引物，通过和靶DNA的变性处理，在DNA聚合酶的作用下，以靶DNA为模板，合成引物之间的DNA片段。PCR过程由温度控制，在引物介导下反复进行热变性、退火、引物延伸3个步骤而扩增，DNA循环过程反复扩增靶分子，特异性地增加靶分子质量，因此可以达到提高敏感性的目的。

目前已知的与疾病感染相关的病原微生物几乎都已建立了相应的PCR检测方法，其原理是通过设计特异的引物对病原微生物的目标基因进行扩增，对细菌的16S rRNA进行扩增，以达到鉴定病原微生物的目的。Riahi等采用双链DNA探针检测泌尿系感染的病原菌，探针设计针对泌尿系常见的致病菌如大肠埃希菌、肠球菌、腐生葡萄球菌，结果证实双链DNA探针的方法与培养结果吻合程度极高。

现在有成品化的多重PCR检验试剂盒如SeptiFast检测试剂盒，为临床快速诊断提供更加便捷的检测。2010年Yanagihara等对212个怀疑由细菌或真菌感染的患者的407份血标本分别进行55份采用SeptiFast诊断技术获得阳性结果，血培养组有43份标本结果阳性。DNA诊断盒明确病原体为11.3%（45/400），血培养明确病原体8.0%（32/400）。结合血培养结果能获得更高的诊断率，尤其是在先期使用过抗菌药物的患者诊断价值更高。但是由于血标本的细菌含量会直接影响检测结果的阳性率，之后不少研究及系统分析认为SeptiFast只是提供了快速的检测手段，但是诊断的阳性率并没有提高，因此可能仍然需要在临床实践中不断摸索，不断前进。

（三）DNA测序

DNA测序是进行突变分析最重要、最直接的方法，不受其他筛选方法敏感性和特异性的限制。DNA测序方法主要包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学裂解法，Sanger双脱氧链终止法更常用，使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物，置入包含4种碱基及一定量的双脱氧核苷酸反应池，当双脱氧核苷酸结合到新合成的DNA上，即可终止DNA链的延伸，进而产生长度不等的DNA片段，再由高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。双脱氧核苷酸的种类不同、掺入的位置不同，在不同位置终止而形成长度不等的互补链。根据双脱氧核苷酸上标记的同位素采取放射自显影读取结果，如今还可使用直接测序法采用四色荧光标记代替放射性同位素标记，避免放射伤害，更加简便。DNA测序经历第一、二代的发展，现在已经开始使用第三代测序技术。

1.第一代测序技术

Sanger测序法最为常用，即双脱氧链末端终止法，基本原理为在测序反应中只加入单端引物，并按照一定比例混入4种具有不同荧光标记的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP），使部分 DNA 链的延伸反应由于缺乏3’-OH而终止，产生了具有相同起始点和不同终止点的DNA片段，再用高分辨率毛细管电泳分离这些片段，检测器依次读取片段末端的荧光信号；最后通过计算机软件将荧光信号解读为DNA序列。

2.第二代测序技术

第二代测序（next-generation sequencing，NGS）在一代的基础上发展而来，既降低测序成本又提高了测序速度，准确性高，NGS在病原微生物的快速检测、溯源及传染病性疾病防控等公共卫生方面发挥很大的作用。常用Solexa测序、SOLiD测序、454测序技术。

（1）Solexa测序技术：

Solexa测序的核心思想是“边合成边测序”，包含“DNA成簇”和“可逆性末端终结反应”两种核心技术。Solexa测序技术可以使用在细菌性传染病应急和预警监测的所有环节过程。Harris等针对儿童医院内部感染的MRSA，通过MiSeq桌面式测序仪快速分析，最终发现医务人员作为病菌携带者，导致儿童监护病房内的持续感染的存在。

（2）SOLiD测序技术：

SOLiD（sequencing by oligonucleotide ligation and detection）测序的核心思想是“边连接边测序”，其核心技术为“油包水PCR”和“连接酶测序法”。采用独特的以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应为基础测序方法。但在微生物研究和细菌性传染病防控领域应用较少。

（3）454测序技术：

454测序又称焦磷酸测序技术，核心思想亦是“边合成边测序”，包含“油包水PCR”和“焦磷酸测序技术”两种核心技术。454新一代基因测序仪提供了一个相对较长的读取长度，从而使对齐各DNA短链的基因序列变得简单直接。454测序具有速度快、通量高、读长长、准确性高、一致性好及简便高效的优势，因此广泛用于微生物群落多样性研究、细菌的全基因测序等研究领域。微生物群落多样性以整个微生物群落基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，研究微生物的多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系的微生物研究方法。

3.第三代测序技术

包括单分子实时测序技术、纳米孔测序技术，可实现对一个DNA分子的序列测定，避免了PCR过程中所引入的偏差和错误，实现对特殊序列的DNA片段的测序。尤其是对于新病原体的鉴定、特定基因元件检测及细菌转录组测序中具有明显的优势。隆云等对78例患者进行的高通量测序与血培养对比，应用PCR方法来进行印证，结果显示1 578份标本的总诊断敏感率：单独使用血培养诊断敏感率为12.82%（10/78），使用NGS升高至30.77%（24/78）。可见基因测序技术可在数小时至数天内获得可靠结果，是细菌性传染病在应急、预警监测和溯源等必备的技术体系。

（四）基因芯片技术

基因芯片技术（gene chip technology，GCT）是近年来发展十分迅速的大规模、高通量分子检测技术。从1979年美国布兰迪斯大学Gergen引入阵列（microarray）概念开始，到1991年美国合成首张寡核苷酸基因芯片，2004年某公司发布了首张美国FDA认证的用于临床诊断的基因芯片（Amplichip CYP450），发展可谓日新月异，不断创新。

GCT的4个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。基本原理是核酸杂交，将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列并固定于支持物上，形成储存有大量信息的DNA阵列（矩阵点），然后与待测的标记样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，获得样品的分子数量和序列信息，进而对基因序列及功能进行大规模、高通量、平行化及集约化的处理和研究。GCT具有信息量大、快速、可进行高通量筛选及数据一致性好等优势。对细菌的监测基于细菌的16S rRNA基因，用于分析临床微生物基因组、基因变异性及多态性，检测细菌耐药基因；病毒方面可做流感病毒、肝炎病毒及HIV的快速检测，还可以对性传播疾病检测（梅毒、生殖器疱疹、淋病、巨细胞病毒感染症、尖锐湿疣等）。

（五）免疫组织化学技术

免疫组织化学又称为免疫细胞化学，其是利用抗原与抗体特异性结合的特性，将特异性抗体用显色剂标记，根据抗原抗体结合反应和化学呈色反应对组织或细胞中的相应抗原进行定位、定性和定量检测的一项技术。目前常用的免疫组织化学方法有免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术和免疫胶体金技术。

由于免疫组织化学技术具有快速、简便、定位准确和特异性强等优点，目前广泛应用于病原体检测、肿瘤病理学检测、肾活检、自身抗体检测及传染病的快速诊断。越来越多的生物标志物包括降钙素原、TREM-1等也在临床感染诊断过程中被广泛使用。

三、基因诊断技术在感染性疾病中的临床应用

（一）病原菌的早期诊断

感染性疾病是病原微生物侵入机体导致的，既往诊断的“金标准”都是等待培养结果，耗时长、阳性率低是影响治疗方案的重要因素。基因诊断恰好可以弥补这方面的部分缺陷，提供快速、准确的检测结果。可以针对各病原体的特异和保守序列设计引物，继而采用PCR技术直接检测病原体的DNA；采用实时荧光定量PCR技术则可以检测RNA病毒。目前已获得部分病原微生物的全部基因序列，因此，将某种病原微生物的特异保守序列集成排列在一块芯片上，可高效、快速、准确地检测出致病病原体，从而对疾病作出诊断。

基因诊断可以做到不需要培养结果即可明确病原菌。NGS针对细菌的16S～23S rRNA区域可以检测出一份标本里可能含有的全部致病菌，而宏基因组（metagenomics）甚至可以用一份标本明确证实多种致病菌（细菌、真菌、病毒等）。另外 Suberviola等将SeptiFast检测与血培养作对比，从6小时诊断效能的角度来说，PCR检验效能是血培养的13倍，也说明基因诊断效率要高出一筹。

有些部位的感染培养阳性率特别低，如中枢神经系统感染，大多数情况下明确诊断中枢神经系统感染需要依靠脑脊液细菌培养，众所周知，脑脊液细菌培养用时较长，还极易受外部情况影响，资料显示脑脊液细菌培养的阳性率不足10%。但是中枢神经系统感染病情重、治疗难度大，早期选择抗菌药物就更加重要。此时采用基因诊断技术具有一定的优势，基因芯片技术能在菌种不明的情况下快速准确诊断病原菌及甄别耐药菌种。王海波等对60例中枢神经系统感染患者的脑脊液进行基因芯片检测耐药基因及病原菌，选取6种常见耐药基因的特异性DNA序列，设计并制作PCR引物及相应的探针，将结果与传统脑脊液培养方法进行对比。传统脑脊液培养方法确诊中枢神经系统感染24例；基因芯片方法确诊中枢神经系统感染30例，24例脑脊液培养阳性的标本均鉴定出与培养一致的菌种，鉴定出耐药基因；即便是未鉴定出菌种的30例标本也大多检出耐药基因。

（二）早期甄别耐药菌株

抗菌药物的广泛使用可引起致病菌株变异及产生耐药性，某些微生物对抗菌药物的耐药是固有的，这些微生物在遗传上具有编码抗菌药物抗药性的固有基因，大规模使用抗菌药物就使得微生物产生选择压力，携带有抗菌药物抗性基因的这些微生物能够在抗菌药物存在的环境中生存下来并逐渐成为特定生境中的优势菌，导致环境中微生物群落结构发生变化。

耐药基因具有高度的可转移性，这些携带有抗性基因的菌株成为优势菌后，加速抗菌药物抗性基因在同种属及不同种属细菌之间的传播和扩散，使临床医师选择合理有效的抗菌药物难度变大，在这种情况下需要找到新的技术，来解决如何快速、准确明确致病菌变，基因诊断在此具有明显的优势。

细菌产生耐药性的遗传基础是基因突变或获得耐药基因，通过针对性检测基因突变或相关耐药基因是细菌耐药性检测和监测的重要手段和途径。通过PCR方法就可以进行耐药性的甄别。包括甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌检测、结核分枝杆菌利福平耐药性检测、超级细菌的检测等。

1.碳青霉烯类耐药菌检测

近年来由于抗菌药物的不合理应用，导致这些临床常见致病菌出现耐药现象越来越严重。其中耐碳青霉烯类的肠杆菌科（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌等）、非发酵菌中以鲍曼不动杆菌尤为严重。

耐药基因的携带与细菌耐药表型是有对应关系的。张丽等采用PCR扩增技术检测耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenems resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）菌株的氟喹诺酮类耐药基因和16S rRNA甲基化酶基因，结果可以看到CRKP与喹诺酮类耐药基因及16S rRNA甲基化酶基因高度相关，其耐药基因主要型别分别是qnrB、qnrS、qnrD和armA。使用基因芯片技术也可以在1天内诊断出肺炎克雷伯菌是否产超广谱β-内酰胺酶或者碳青霉烯酶，作为制订治疗方案的依据。

不动杆菌产碳青霉烯酶为D型酶——OXA，我国资料显示绝大多数耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌（carbapenems resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）产OXA23，但是不同地区可能存在不同情况。陈勇等采用PCR方法对我国西北地区一家军队医院的107株鲍曼不动杆菌的耐药性进行检测，结果发现，77.2%对碳青霉烯类耐药，57.7%CRAB携带OXA-72基因，只有42.3%的CRAB携带OXA-23基因。

2.结核病耐药菌检测

全球结核病形式急剧恶化，结核病在世界范围内呈快速上升趋势。结核分枝杆菌如果同时耐受异烟肼和利福平，就成为难治性结核病，病死率大大增加。世界卫生组织估计，目前能够明确诊断多重耐药结合杆菌的比例达不到实际发生率的45%。由于结核的测定时间周期长（结核菌生长缓慢，耐药菌的生长更加缓慢）、精度不高，临床药敏试验很难指导结核病的用药，更加难以在疾病早期根据耐药性制订治疗方案。

基因芯片用于快速检测耐药结核菌，指导个体化用药具有非常重要的意义。Wilson等运用基因芯片技术研究发现，肺结核分枝杆菌的脂肪酸合成酶Ⅱ、铁转运ATP结合蛋白C、膜转运蛋白、酰基辅酶A脱氢酶（fadE23、fadE24）、烷基过氧化氢还原酶C蛋白等基因的改变与异烟肼、乙硫异烟胺耐药性有关，提供了新药物作用的靶目标，并指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成。Farhat等的研究结果显示，采用分子逆向探针技术诊断对异烟肼和利福平的耐药性，敏感性和特异性均超过90%，13种抗结核药的18个基因位点一共检测到发生了238个突变点，且Farhat等认为仍存在未被发现的基因簇，需要识别整个抗结核药的耐药基因决定簇，未来全基因组测序将成为更有吸引力的诊断方法

（三）院内感染暴发的追踪

细菌基因组多样性是由基因突变和不同菌株之间的基因交换等一系列过程所形成的，即便是极其相似的同一种菌属的不同分离菌株也会有差异，通过这些基因的检测就可用来分辨菌株，再把细菌性病原体的基因组数据与传统的流行病学空间和时间数据进行汇总，进行细菌病原体的流行病学分析，为公共卫生干预提供依据。

细菌全基因组分型通过对比分析细菌基因组的单核苷酸多态性，可以确定不同分离菌株之间的流行病学关联性，并可以推演细菌在过去几年内，乃至几个月内的进化过程。由于治疗的需要，有些携带耐药基因病原菌的患者需要在不同的医院、社区康复中心、养老护理中心等机构转介，这就不可避免造成致病菌在这些机构流行，通过基因诊断进行回顾性分析，理清这些患者的转诊线路，对院内感染的防控起到良好的作用。Zhou等通过新的全基因测序法，对2012～2015年10余例产CTX-M-15型酶的肺炎克雷伯菌患者在2家医院、1个社区康复中心转诊后发生的院感暴发，最终明确了感染来源。

重症医学科感染病原菌的来源追踪也是一个很重要的环节，很多时候我们要明确致病菌是重症医学科外带入或者是重症医学科内患者-患者的传播，鉴定结果可以作为重症医学科院感质控的重要考核指标。传统的检测方法很多时候并不能精确鉴定，而通过基因测序就可以证实菌株的同源性，来自英国的一项研究使用全基因测序法对MRSA在院内感染的鉴定结果显示，尽管在1109例患者中检测到185株MRSA，全基因测序法检测发现通过患者-患者传播的MRSA所占比例仅有1例，采用传统检测方法则将3例错判为患者-患者传播。由此可见，若按照传统检测方法，就应该判断该重症医学科内对MRSA的控感隔离措施存在严重问题，但是有全基因测序法检测数据的支持，可以减免医务人员的部分责任。

总之，基因检测技术在感染诊断中可以发挥越来越多的作用，而且技术的进步也必将为医患带来更多的益处，早期诊断、有效识别病原菌，尤其是在发生耐药菌感染的时候基因鉴定也可以作为制订用药原则的有效依据。