重症感染是重症患者常见疾病之一，也是导致重症患者死亡的重要原因之一。随着高龄患者、免疫相关疾病患者的增多，以及广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制药物的广泛应用，侵袭性真菌感染（invasive fungal infections，IFI）在重症感染中所占的比重也在逐年上升。重症监护病房中的侵袭性真菌感染患者一般可分为两大类：一类具有免疫抑制基础，如免疫疾病患者，或血液系统肿瘤、实体肿瘤放化疗后的患者。这类人群由于原发病的因素，对真菌感染处于高易感状态，也是其他机会感染，如卡氏肺孢子虫、病毒的常见侵袭对象。另一类患者在患病前并无免疫抑制基础疾病，往往是因为解剖生理屏障完整性被破坏，以及在严重创伤、烧伤、多器官功能损害等多重打击下，发生侵袭性真菌感染。无论何种原因引起的真菌感染，早期诊断和治疗都是降低病死率、改善患者预后的核心。

由于侵袭性真菌感染早期临床症状不明显，临床表现缺乏特异性，且常规的真菌分离、培养和组织病理鉴定耗时较长，使得早期诊断侵袭性真菌感染面临巨大的挑战。在这种情况下，早期、快速、灵敏、特异的真菌相关生物标志物诊断技术越来越受到临床医务人员的重视，也发挥出巨大的应用价值，已成为临床不可或缺的侵袭性真菌感染诊断指标之一。以下介绍5种比较有价值的真菌相关生物标志物检测方法。

一、（1，3）-β-D-葡聚糖试验

1.概述及原理

（1，3）-β-D-葡聚糖试验也称为G试验，可检测除接合菌和新型隐球菌以外的所有类型侵袭性真菌感染。葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的 80%～90%，其中（1，3）-β-D-葡聚糖占真菌细胞壁成分的 50%以上；而其他微生物、动物及人的细胞则不含该成分，因而其可作为真菌感染的特异性标志物进行检测。

（1，3）-β-D-葡聚糖的结构是由（1，3）-β-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状1-6-β-D葡萄糖残基作为侧链构成。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬和消化等处理后，（1，3）-β-D-葡聚糖可从细胞壁中释放入血液及其他体液，特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子产生蛋白酶，引起裂解物凝固，故称为G试验。而在浅部真菌感染中，（1，3）-β-D-葡聚糖往往未被充分释放，故其在血液及体液中的含量不高。由于接合菌细胞壁不产生（1，3）-β-D-葡聚糖，因此无法通过G试验检测。而新型隐球菌细胞壁外有荚膜多糖包裹，掩盖了细胞壁上的抗原，即使在一定条件下荚膜自身释放出微量的（1，3）-β-D-葡聚糖到血液中，也达不到阳性判断标准。

2.检测方法

目前市场上有多种G试验检测方法，不同方法使用的阳性界值标准也各不相同。如日本开发研制的Fungitec-Gglucan试剂采用东方鲎的细胞裂解产物作为主要原料，其阳性界值定为20ng/L。而美国的Gluca-tell试剂则使用美洲鲎的细胞裂解产物，阳性判断标准常为60ng/L。一项荟萃分析结果显示，G试验在确诊和拟诊IFI的敏感度为76.8%，特异度为85.3%，在确诊患者中的诊断敏感度为79.1%，特异度为87.7%。另一项研究显示，对于念珠菌脓毒症患者，G试验的阳性预测值为72.7%，阴性预测值为98.7%。而在体液中，以G试验大于20pg/ml为诊断界值，G试验的敏感性为90%，特异性为84%～100%。

3.临床应用

（1，3）-β-D-葡聚糖试验是早期诊断侵袭性真菌感染有效检测手段之一，可以为临床选用适宜的抗菌药物提供依据。有研究显示，在发现临床表现及微生物学证据前，血清中（1，3）-β-D-葡聚糖水平已经高于正常值。如粒细胞缺乏患者中，（1，3）-β-D-葡聚糖高于正常值的时间比临床诊断与最后确诊真菌感染平均提前10天左右。此外，（1，3）-β-D-葡聚糖水平还可提示疾病的发展和预后。侵袭性真菌感染患者，随着有效抗真菌药物的应用，可很快出现（1，3）-β-D-葡聚糖水平下降及转阴，而药物治疗无效的人群（1，3）-β-D-葡聚糖值无明显改变。 虽然连续监测（1，3）-β-D-葡聚糖水平对于侵袭性真菌感染的治疗效果及预后评估有意义，但尚不能单凭（1，3）-β-D-葡聚糖值降至正常作为停止抗真菌治疗的标准。

（1，3）-β-D-葡聚糖试验也存在着一定的局限性。其易受到内毒素的污染，影响检测结果的准确性。而输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血制品、使用纤维素膜滤器进行血液透析、输注抗肿瘤的多糖类药物、标本或患者接触纱布或其他含有葡聚糖的材料等都会造成假阳性。部分肺曲霉病因为厚壁空洞的包绕，真菌细胞壁的残余结构难以释放入血，也会造成假阴性的结果。 另外，（1，3）-β-D-葡聚糖试验不能鉴别是何种真菌感染，仅能定性诊断，在临床应用上还缺乏具体指向性。

二、半乳甘露聚糖试验

1.概述及原理

半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）试验是诊断侵袭性曲霉感染的特异生物学检查技术。一般情况下，侵袭性曲霉感染的确诊需要组织或细胞病理见到真菌及其引起感染的证据，或无菌部位培养出曲霉生长，但实际诊疗中，组织标本不易得到，培养也需要较长时间，往往延误曲霉感染的诊断。半乳甘露聚糖是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁中的一类多糖，其基本化学结构是以 β-（1，4）-苷链连接成的 D-吡喃甘露糖为主链，以 α-（1，6）-苷链连接成的 D-吡喃半乳糖为支链，其半乳糖残基具有抗原性。

2.检测方法

半乳甘露聚糖试验采用酶联免疫吸附试验检测。一项荟萃分析结果显示，界值为1.0μg/L时，确诊病例中 GM试验的敏感度为68%，特异度为90%；当界值降至0.5μg/L时，敏感度升高至82%，特异度降至77%。我国多采用0.5μg/L作为临界标准。有研究对不同界值（0.5、0.6、0.8、1.0μg/L）进行比较，发现采用 0.5μg/L时，敏感度及特异度均较好，有助于早期诊断及治疗。GM试验还可用于支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和尿液、脑脊液的检测。BALF的GM试验对曲霉菌诊断的敏感度可达到70%～94%，特异度达到85%～92%。若联合PCR检测血曲霉菌DNA，可进一步提高诊断的准确性。

3.临床应用

GM试验主要适用于侵袭性曲霉感染的早期诊断。有研究表明，对于深部曲霉感染患者，血清GM试验增高可比影像学诊断提前7天。此外，GM试验还可用于高危人群曲霉菌感染监测，抗真菌治疗疗效监测，其检测值连续2次低于诊断界值提示病情好转。

GM试验也会受其他因素干扰，产生假阳性及假阴性结果。食用某些含甘露聚糖的食物（如含有半乳甘露聚糖的牛奶等高蛋白食物和污染的大米等）、静脉应用哌拉西林-他唑巴坦，血液透析，新生儿和儿童等因素可导致GM试验假阳性。假阳性率可达18%。而释放入血的GM数量少、血中存在高滴度抗体、测试前应用抗真菌药物等都可使GM试验呈现假阴性。由于上述情况的存在，GM试验阴性不能完全排除侵袭性曲霉感染，单纯GM试验阳性也不是确诊曲霉感染的依据。

三、隐球菌荚膜多糖抗原检测

1.概述及原理

新型隐球菌感染后可在体内形成大量荚膜多糖并释放入血和脑脊液，通过检测血清和脑脊液中的荚膜多糖抗原含量可早期、快速诊断隐球菌感染。

2.检测方法

隐球菌荚膜多糖抗原的检测包括乳胶凝集法（latex agglutination，LA）、酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）和侧向层析法（lateral flow assay，LFA）。乳胶凝集法是将抗隐球菌荚膜多糖抗体吸附于标准大小的乳胶颗粒上，用标本稀释液倍比稀释被检液体，取倍比稀释后的被检液体样本与乳胶试剂混合，然后通过主观判断凝集程度确定感染可能性。当检测样本无颗粒，为均匀乳浊液时不支持新型隐球菌感染。细小颗粒，乳白色背景为（+）；小凝块，云雾状不均匀背景为（++）：小凝块及大凝块，悬浮液背景为则提示（+++）：大的絮状凝块，背景清晰为（++++）。一般取≥（++）为阳性结果，效价值为稀释倍数。乳胶凝集法还可能受到类风湿因子的影响，两者之间存在交叉反应，可造成假阳性。

酶联免疫法通过多克隆抗体捕获抗原，再用单克隆抗体进行定量检测，其敏感度和特异度更高，结果不受类风湿因子等的干扰，可以实现自动化结果分析。LFA法在室温下稳定，反应时间快，对实验室条件要求较低，还可作为床旁初筛的方法。

3.临床应用

血清或脑脊液荚膜多糖抗原滴度增高提示预后不良，高滴度与全身高隐球菌负荷和隐球菌高定量计数有关，是患者在接受全身系统抗真菌治疗预后不良的预测因素之一。此外，通过动态监测荚膜多糖抗原滴度可作为制订治疗方案的参考。有效治疗后，抗原滴度一般会逐渐降低，抗原滴度持续升高则提示感染未得到有效控制或产生耐药。但在感染治愈后，免疫功能低下的患者仍很难将抗原完全清除，其乳胶凝集试验阳性仍可持续相当长时间。

乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原存在着非特异性干扰，类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、结节病和结核等患者血清中的类风湿因子、巨球蛋白会对检测结果产生影响，导致假阳性结果。而由于出现前带效应（虽有一定浓度的抗原存在，但因抗体过剩使反应信号弱化），可引起假阴性。多次送检、抗体稀释可解决此问题。

四、甘露聚糖检测

甘露聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，是真菌细胞壁的重要组成成分。不同真菌中的甘露聚糖含量和作用各不相同，其在真菌致病过程中参与免疫调节和防御。甘露聚糖的检测方法类似于半乳甘露聚糖试验。有研究显示：用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血液中甘露聚糖，其阳性结果与念珠菌感染有很好的相关性。但由于血液中甘露聚糖清除较快，导致检验敏感性较低，限制了其临床应用。

五、烯醇化酶检测

烯醇化酶又称为2-磷酸-D甘油盐水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，广泛存在于念珠菌细胞中。在深部念珠菌感染时可大量释放入血，具有很高的临床应用价值。用斑点免疫结合试验和双夹心微脂粒免疫法对肿瘤、深部组织感染及菌血症患者检测，敏感性为64%～85%，特异性为96%。可通过监测患者血清中抗烯醇化酶抗体及抗体滴度的动态变化来评估念珠菌感染可能性。

侵袭性真菌感染的早期诊断对于治疗和预后至关重要。真菌相关生物学标志物的应用大大提高了诊断的时效性。尽管许多生物学标志物还未建立成熟的检测方法和流程，未能在临床广泛开展，但真菌特异性抗原、抗体及分子生物学检测已显示出其巨大的临床价值。将其与传统的真菌涂片培养，以及患者的主观感受结合起来，一定会使真菌感染的诊断迈上新的台阶。

（汤 铂）