在人的体表和与外界相通的腔道中寄居着大约100万亿、1000余种细菌，其数量是人体细胞的10倍，一般情况下，这些细菌与人体处于共生状态，我们称为共生性细菌（commensal bacteria）、正常微生物群（normal microflora）、共生微生物群（commensal microbiota）或菌群（microbiota），菌群与宿主的共生关系是细菌与人类经过亿万年互为环境，同步进化的结果。研究共生微生物群与人体之间相互关系的学科就是医学微生态学（medical microecology），与传统的医学微生物学（medicalmicrobiology）不同，医学微生物学研究的对象是与人类疾病有关的病原微生物。
 
随着非依赖培养的高通量测序技术和生物信息分析技术的飞速发展和应用，发现人体中大多数的微生物是无法依靠现有的培养技术所呈现，并且人体中微生物所编码的基因数量是人体自身基因的100倍，这些存在于人体中所有微生物及其基因的总和，组成了人体的微生物组（microbiome）。
 
人体微生物组构成了人类的第二套基因组，与人类自身的基因组一起，共同作用于人体的免疫、营养和代谢过程，影响着人体的健康和疾病。微生物组与人类疾病的研究进入了黄金时代，主要的表现是肠道共生菌群与肥胖、糖尿病、冠心病、炎症性肠病等已经取得了突破性进展，同样呼吸道和肺的微生物组与呼吸系统急性感染及慢性疾病的关系也引起了全世界的关注，并且取得了重要的进展。
 
一、微生物组及其技术
 
在过去一百多年时间里，人们对于微生物的认识和研究主要是建立在纯培养基础上，即针对单一种细菌进行分离培养，然后通过形态学、生化反应和分子生物学进行鉴定等。微生物组研究技术或宏基因组学（metagenomics）技术是一种不依赖于传统的细菌培养与鉴定，直接从样品中提取基因组DNA后进行测序，生物信息分析，获得活性物质和功能基因的新技术。微生物组检测的微生物既包括了可培养的，又包括了目前条件下无法培养的微生物遗传信息。目前认为人体中约40%～80%的细菌是不能通过传统纯培养技术培养出来的。微生物组技术绕过了菌种纯培养的缺陷，极大地扩大了我们认识微生物的视野，这是人类继发明显微镜以来研究微生物方法的最重要进展，将是对微生物世界认识的革命性突破。
 
微生物组研究的核心方法是高通量测序和生物信息分析。高通量测序技术（high-throughput sequencing）又称下一代测序技术（next-generationsequencing technology，NGS），一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，又被称为深度测序（deep sequencing）。高通量测序技术应用于微生态研究包括16S rDNA测序和宏基因组测序，其中前者针对细菌核糖体的16S亚基，主要用于标本中细菌群落的组成分析，后者能检测出标本中所有微生物基因序列（包括细菌、真菌以及病毒等），不仅能够分析微生物群落的组成，还可以分析基因的功能等。生物信息分析中所呈现的结果和统计的方式与传统的微生物检测和研究不同，主要有操作分类单位（operational taxonomic units，OTU）、微生物多样性分析（Shannon-Wiener指数）、物种组成与丰度分析、进化关系分析、主成分分析（principal component analysis，PCA分析）、聚类及相关性分析和基因功能注释分析等。
 
在微生物组研究中微生物群落的组成可以以门（phyllum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）和种（species）不同分类水平进行表达，目前的高通量测序能将微生物大部分鉴定到属水平，常常以门水平和属水平进行分析，这与临床医生日常工作中以细菌的种水平来分类有所不同。根据目前的研究报道，呼吸道菌群大部分属于5个菌门（表1）。
 
表1 呼吸道常见菌群在门和属水平的分类对照

 
二、正常人呼吸道及肺微生物组的组成
 
呼吸道通常以环状软骨下缘为界，分为上、下呼吸道，上呼吸道包括鼻、鼻窦、咽、咽鼓管、会厌及喉；下呼吸道包括气管、支气管、毛细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管及肺泡。基于传统的培养技术已经证实，上呼吸道有大量的细菌等微生物定植。鼻腔是呼吸道与外界相通的开端，也是皮肤与黏膜的延续部分，因此鼻腔特别是鼻前庭的菌群与皮肤菌群类似，主要为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、各型链球菌、棒状杆菌和丙酸杆菌等。咽喉既是呼吸道，又是连接口腔与食管的消化道，接受空气和食物，这种特殊的结构和内容决定了其菌群非常丰富，是呼吸道菌群的主要定植场所，其主要菌群为甲型溶血性链球菌（草绿色链球菌），次要菌群包括奈瑟氏菌、棒状杆菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、流感嗜血杆菌、韦荣氏菌（厌氧菌）和念珠菌等。由于声门的阻挡作用，既往认为在声门以下的下呼吸道和肺是无菌的，但随着支气管镜检查获取下呼吸道标本如支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）技术的普及和不依赖细菌培养的16SrRNA细菌基因测序技术的应用，目前发现在正常健康人的下呼吸道和肺也有细菌定植。实际上无论上呼吸道，还是下呼吸道均是通过呼吸运动与外界相通的，又由于上呼吸道分泌物经常通过微量吸入到达气管支气管，所以整个呼吸道均有细菌定植是不足为奇的。
 
2011年Charlson等首先采用16S rDNA Q-PCR扩增和焦磷酸深度测序技术，对6名正常人的鼻咽、口咽、声门水平吸引物、右中叶支气管邻近的支气管肺泡灌洗液（BALF）和左下叶支气管黏膜表面（使用双套保护毛刷，PSB）等10个部位的标本进行了细菌DNA检测和分析。结果显示，鼻咽部菌群在不同部位有所不同，鼻前庭以葡萄球菌（Staphylococcus）、丙酸杆菌（Propionibacterium）和棒状杆菌（Corynebacterium）为主，与皮肤菌群类似，还有与口腔相同的菌群如链球菌（Streptococcus）、韦荣球菌（Veillonella）和普雷沃菌（Prevotella）；口咽部含丰富的链球菌、韦荣球菌、梭杆菌（Fusobacterium）和奈瑟菌（Neisseria）；声门水平的菌群种类和分布与口咽部位类似；下呼吸道包括三个部位的BAL和PSB的菌群类型和分布在6名受试者相同，也与上呼吸道菌群类似，只是数量低2～4个级别，没有发现下呼吸道特有的菌群。本研究提示整个呼吸道菌群存在高度的同源性，下呼吸道菌群仅仅是上呼吸道菌群的一种延续，只是体现在生物量的不同，从上呼吸道到下呼吸道，菌群数量逐渐减少[1]。
 
2015年Dickson对15名健康成年人的左舌叶和右中叶进行支气管肺泡灌洗（BAL），然后对右上叶、左上叶和声门上进行保护毛刷（PSB）收集样本，采用16S rDNA技术测序，了解呼吸道不同部位的微生组空间分布。结果显示2种方法收集的样本检测没有区别，肺内不同部分的微生组也没有各自特定的菌群；同一个体不同部位之间的微生物组的差异明显小于不同个体间的差别；在微生物组的丰富程度、组成和相似度方面，右上叶样本比远端部位更接近于上呼吸道样本；肺微生物组依次为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）。作者认为正常人下呼吸道和肺的菌群是细菌不断迁入（微量咽喉反流、吸入）和不断去除（咳嗽、黏液纤毛清除）达到平衡的结果，随着从上呼吸道向远端的延伸，菌群的丰富度减少[2]。
 
为了了解肺微生物组的来源，一项研究对28名健康人的口腔、鼻腔、胃液和支气管肺泡灌洗（BALF）样本进行了定量PCR和16SrRNA测序，结果表明口腔和胃液含有的细菌量及细菌的丰富度高于鼻腔和的肺部；尽管肺部的菌群与口腔、鼻腔和胃液不同，但是肺部与口腔存在一些共同菌群，而鼻腔缺乏这些菌群，研究提示正常情况下肺部微生物可能主要来源于口腔微生物的微量反流[3]。
 
三、儿童呼吸系统疾病中的微生物组变化
 
（一）肺炎
 
肺炎至今仍然是儿童最常见的疾病之一，也是引起5岁以下儿童死亡的最主要的病因，明确肺炎的病原菌及其致病机制是处理肺炎的关键性措施，但是目前仍然存在很大的挑战。经典的研究认为肺炎是单一病原体侵入肺部并且增殖引起的，但是最近关于呼吸道微生物组的研究揭示了人体的上下呼吸道是一个连续的复杂的生态系统，所谓的病原体致病很可能是呼吸道微生态失衡的结果，由此提出了肺炎可能是一种多微生物致病机制[4]。2014年Sakwinska首先研究了50例肺炎患儿和50名正常儿童鼻咽部菌群变化，采用16S rDNA进行检测，结果肺炎患儿鼻咽菌群的丰度和多样性明显低于正常儿童，病毒性肺炎患儿鼻咽中优势菌为腔隙莫拉菌（Moraxella lacunata），非细菌性肺炎患儿鼻咽优势菌可以分为3种类型，分别为以肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌为主的复合型，病原不明的肺炎则为流感嗜血杆菌为主的复合型，而在正常儿童鼻咽中并没有观察到特异的优势菌群[5]。Pettigrew研究了呼吸道菌群在儿童社区获得性肺炎（CAP）中的作用，纳入了383名6个月到18岁CAP住院患儿，对诱导痰、鼻咽和口咽（NP/OP）样本进行16S rDNA测序，发现诱导痰和NP/OP样本菌群的相对丰度不同，在6个月至5岁的肺炎儿童，诱导痰中较多的放线菌属、韦荣球菌属、罗氏菌属和乳杆菌科与住院时间大于4天呈负相关；诱导痰中嗜血杆菌属和巴斯德菌科较高的相对丰度及链球菌属较低的丰度与转入ICU呈正相关。在5～18岁的肺炎儿童，诱导痰中卟啉单胞菌科、拟杆菌科、乳杆菌科和普雷沃菌属较高的相对丰度及链球菌属较低的丰度与住院大于4天呈正相关。没有发现鼻咽和口咽中特定菌群结构和CAP严重性相关。本研究提示痰可以作为了解CAP菌群组成的样本，5岁以下和以上CAP病情严重程度与不同的菌群组成相关，特定的菌群组成与肺炎的病情有关，一些特定细菌，特别是革兰阴性菌的增多与CAP的病情加重有关[6]。我们最近的研究纳入了32例需要行支气管镜检查的肺炎患儿，分别收集鼻咽、口咽和支气管肺泡灌洗（BALF）样本，另纳入32名年龄相同的正常儿童作为对照，采集鼻咽和口咽样本，进行16S rDNA测序。发现肺炎患儿鼻咽和口咽菌群与健康儿童差异明显，肺炎患儿的鼻咽和口咽分别富集乳杆菌属、芽胞杆菌属、链球菌属和链球菌属、棒杆菌属、狡诈球菌属、支原体属；肺炎患儿的BALF富集的菌属与口咽部更接近。并且发现与口咽、BALF细菌培养及肺炎支原体PCR检测比较，BALF16S rDNA测序对病原体的检测具有更高的覆盖度。
 
下呼吸道感染是引起需要气管插管和机械通气的呼吸衰竭的主要原因，也是插管中常见的并发症，造成死亡率增加。一项研究观察了成年人插管以后呼吸道菌群的动态变化与发生肺部感染的关系，发现在15例（4例入组时有CAP/HAP）需要插管病人中，在插管的24小时内口咽和插管深部分泌物的菌群的多样性均明显低于对照组，随着机械通气时间的延长，其多样性进一步减少，4例临床诊断为呼吸机相关肺炎（VAP）的病人其菌群多样性随着时间延长更少，而主要富集某一单一菌，其中3例与临床常规细菌培养一致（2例金黄色葡萄球菌、1例假单胞菌）。另外16S rDNA测序鉴定出2例病人有致病性细菌的富集，而培养为阴性[7]。另外一项研究纳入了35例接受气管插管和机械通气的重症成年患者，每周3次收集患者的气管抽吸液进行16S rRNA基因测序分析呼吸道微生物组的组成。35例患者中获得111个气管吸出物标本，其中11例发生呼吸机相关性肺炎（VAP），18例没有发生VAP，另外6名患者在气管插管后48小时内发生了肺炎。结果表明，菌群多样性下降与机械通气持续时间有关，而与抗生素治疗不相关；与对照组比较，发生VAP的患者菌群的β多样性存在显著的差异，霍尔德杆菌、芽胞杆菌和假单胞菌在较小的程度上与β多样性改变呈正相关。本研究提示机械通气而不是使用抗生素，与呼吸道微生物的变化有关，吸道内的微生物群落失调在发生VAP患者中更加明显[8]。
 
（二）毛细支气管炎
 
毛细支气管炎是婴幼儿常见的疾病之一，主要由呼吸道合胞病毒（RSV）引起。2016年一项研究纳入了1005例1岁以下住院的毛细支气管炎患儿，采用16S rDNA测序技术检测患儿住院24小时内鼻咽菌群情况，以探讨菌群与病情严重程度的关联，结果从鼻咽部鉴定出4种菌群结构，核心菌分别为嗜血杆菌（19.2%）、链球菌（28.2%）、莫拉菌（21.9%）和混合菌（30.7%，即不能明显区分为单一核心菌）；关联分析显示以嗜血杆菌为主要的菌群组，入PICU次数多，且住院时间长；而以莫拉菌为主的患儿，病情最轻，进一步研究发现该规律只发生于血清中抗菌肽浓度较低的患儿（LL-37≤46ng/ml）[9]。另外一项研究则探讨了RSV感染患儿鼻咽菌群与病情、免疫相关因子（转录组）的关系，结果从鼻咽部鉴定出5种核心菌群，分别为流感嗜血杆菌、链球菌、棒状杆菌、莫拉菌和金黄色葡萄球菌；合胞病毒感染及其住院与流感嗜血杆菌或链球菌为主的菌群呈正相关，而与金黄色葡萄球菌呈负相关，在流感嗜血杆菌或链球菌为主的菌群组，宿主的TLR受体、中性粒细胞和巨噬细胞激活信号关联基因表达增加，而RSV感染患儿宿主的干扰素基因表达量上升与菌群无关。本研究提示RSV与鼻咽部菌群的相互作用可能调节宿主的免疫反应，决定病情轻重[10]。
 
（三）其他疾病
 
囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）是白种人儿童最常见的遗传性、慢性呼吸道疾病之一，关于CF患儿的鼻咽微生物组研究显示，呼吸道菌群的异常在CF的进展加重中发挥了重要的作用[11,12]。
 
关于哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺结核、肺移植、支气管扩张等呼吸道微生物组的研究，也有许多报道，但研究的对象主要是成年患者。
 
四、展望
 
人们对呼吸道菌群和微生物组的了解远没有对肠道深入，这一方面是由于客观上呼吸道菌群的数量比较少，其重要性可能没有肠道重要，另一方面对呼吸道菌群的研究手段受获取标本的限制。呼吸道菌群对宿主的作用可能包括拮抗外来致病菌的侵入和繁殖，以及对呼吸道局部黏膜免疫发育成熟的刺激。关于呼吸道疾病与局部菌群的关系，尽管目前的了解是初步的，但随着研究的深入，将来有可能为进一步了解呼吸疾病的发病机制、寻找疾病表型的标志物以及干预的新靶点提供新的思路。
 
参考文献
 
1.            Charlson ES, Bittinger K, Haas AR, et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J RespirCrit Care Med, 2011, 184:957-963.
2.            Dickson RP, Erb-Downward JR, Freeman CM, et al. Spatial variation in the healthy human lung microbiome and the adapted island model of lung biogeography. Ann Am ThoracSoc, 2015, 12(6):821-830.
3.            Bassis CM, Erb-Downward JR, Dickson RP,et al. Analysis of the upper respiratory tract microbiotas as the source of the lung and gastric microbiotas in healthy individuals. MBio, 2015, 6(2):e00037.
4.            Dickson RP, Erb-Downward JR, Huffnagle GB. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med, 2014, 2(3):238-246.
5.            Sakwinska O, BasticSchmid V, Berger B,et al. Nasopharyngeal microbiota in healthy children and pneumonia patients. J ClinMicrobiol, 2014, 52(5):1590-1594.
6.            Pettigrew MM, Gent JF, Kong Y, et al. Association of sputum microbiota profiles with severity of community-acquired pneumonia inchildren. BMC Infect Dis, 2016,16:317.
7.            Kelly BJ, Imai I, Bittinger K, et al.Composition and dynamics of the respiratory tract microbiome in intubated patients. Microbiome, 2016,4:7
8.            Zakharkina T, Martin-Loeches I, Matamoros S, et al. The dynamics of the pulmonary microbiome during mechanical ventilation in the intensive care unit and the association with occurrence of pneumonia. Thorax, 2017,72(9):803-810.
9.            Hasegawa K, Mansbach JM, Ajami NJ, et al. Association of nasopharyngeal microbiota profiles with bronchiolitis severity in infantshospitalised for bronchiolitis. EurRespir J, 201,48(5):1329-1339.
10.          de SteenhuijsenPiters WA, HeinonenS,Hasrat R,et al. Nasopharyngeal microbiota, host transcriptome,and disease severity in children with respiratory syncytial virus infection. Am J RespirCritCareMed, 2016,194(9):1104-1115.
11.          Prevaes SM, de Winter-de Groot KM, Janssens HM, et al. Development of the nasopharyngeal microbiota in infants with Cystic Fibrosis. Am J RespirCrit Care Med, 2016,193(5):504-:515.
12.          Prevaes SM, de SteenhuijsenPiters WA, de Winter-de Groot KM, et al. Concordance between upper and lower airway microbiota in infants with cystic fibrosis. EurRespir J, 2017,49(3): 1602235.